קטילת החיידק Pseudomonas aeruginosa המאופיין בזיהומי כוויות, באמצעות שדות חשמליים

גילוי האנטיביוטיקה פניצילין ע"י אלכסנדר פלמינג בשנת 1928 הווה תפנית דרמטית בעולם הרפואה ועזר להציל מיליוני אנשים מזיהומים שמקורם בחיידקים מחוללי מחלה. הודות למחקר והיצור התעשייתי המסיבי, האנטיביוטיקה הפכה במהרה לתרופה זמינה בעלת שימוש רווח מאד ולעיתים לא מפוקח. כמויות גדולות של אנטיביוטיקה זלגו לסביבה דרך מערכות הביוב ובמהרה, נתגלה כי גם החיידקים למודי הניסיון בעולם משיבים מלחמה. זנים של חיידקים עמידים לאנטיביוטיקות נתגלו ברחבי העולם עם מגמה הולכת וגדלה של אנטיביוטיקות שהפסיקו להיות אפקטיביות כנגדם. מקטעי ה-DNA שמקודדים למנגנוני העמידות נמצאים על יחידה ניידת הקרויה פלסמיד וניתנים להעברה דרך מנגנון הפילי בין זני החיידקים השונים מה שהופך את העמידות לאתגר מורכב עוד יותר. בתגובה לפיתוח העמידות מצד החיידקים הפתוגניים, מדענים סנתזו אנטיביוטיקות מלאכותיות המבוססות על הנגזרות הטבעיות של אנטיביוטות הקיימות, אך במרוץ החימוש הזה, זה רק עניין של זמן עד שהחיידקים יפתחו גם כנגדם מנגנוני עמידות והקרב נראה אבוד מראש. אחד התחומים בהם הבעיה אקוטית במיוחד היא תחום זיהומי הכוויות. חולים שסובלים מכוויות הם חולים עם שטחים גדולים של רקמה חשופה לזיהומים ובהעדר הגנה טובה של העור חולים אלו נוטים לפתח זיהומים חמורים בקלות. חיידק ה- Pseudomonas aeruginosa הוא אחד מן החיידקים הנפוצים ביותר, שבודדו מחולים הסובלים מזיהומי כוויות. הודות ליכולות העמידות שלו והשרידות שלו בסביבת בית החולים הוא הפך לאחת מן המטרות המרכזיות בניסיון ההתמודדות עם הזיהומים . על מנת לפתור את בעיית הטיפול בחיידקים העמידים, כדוגמת ה- Pseudomonas aeruginosa אנו מציעים שימוש בשיטת האקטרופורציה. השימוש בשיטת זו יוצר מיקרו-קרעים בממברנה החיידקית וגורמים לליזיס התא. 

תחילה, על מנת לכייל את המערכת של המחולל הפולסים נבנה מטריקס טאגוצ'י (שיטה השוואתית הבוחנת את עוצמת ההשפעה של פרמטרים בדידים בתהליך ומגדירה מי מבניהם הוא הפרמטר המשמעותי ביותר למקסום היעילות של תהליך). מטריקס זה בחן את ארבעת הפרמטרים של הפולס: מתח חשמלי, אורך הפולס, מספר הפולסים וההפסקות בין הפולסים (תדירות). על סמך הניסויים גילינו כי הפרמטר של אורך הפולס הוא הפרמטר המשפיע ביותר בטווח המדידות שנבחנו ועל בסיס הניסויים הנ"ל עוצבה מערכת ניסוי חדשה ששמה דגש על הפרמטר של אורך הפולס ויושמה במכשיר שנבנה במעבדה מסוג IGBT. בהמשך, נבחנה היכולת של פעילות סינרגיסטית בין האנטיביוטיקה והאלקטרופורציה, מתוך ההבנה שמרבית מנגנוני ההתגוננות של החיידקים נגד אנטיביוטיקה ממוקמים על גבי הממברנה והיא זו שמהווה את המחסום העיקרי לחדירות האנטיביוטיקה אל תוך חלל התא והציטופלסמה. הרעיון של יצירה מכוונת של "חרירים" בממברנה התאית שיאפשרו השפעה מועילה יותר של אנטיביוטיקה יחד עם האלקטרופורציה כשהשלם עולה על סמוך חלקיו. המערכת נוסתה על 2 מינים של חיידקים, האחד הוא Pseudomonas aeruginosa והשני הוא Staphylococcus epidermidis כאשר לכל אחד מהם יש מורפולוגיה שונה (פסאודומונאס מתג ואילו הסטפילוקוקוס כדורי) וממברנה שונה (פסאודומונאס גרם שלילי וסטפילוקוקוס גרם חיובי). הודות לשוני בצורה והממברנות נמצא כי בתנאים של  pHניטרלי החיידק Pseudomonas aeruginosa נמצא רגיש יותר לטיפול המשולב של אנטיביוטיקה (אל אף שהמיקס האנטיביוטי הכיל רכיבים המכוונים גם נגד גרם שלילי וגם נגד גרם חיובי) ואפילו בריכוזי אנטיביוטיקה נמוכים (המיהול המקסימלי של פי 20), עדיין היה אפקטיבי יותר מאשר כל אחד מהטיפולים בנפרד. התוצאה שהתקבלה מצביעה על היכולת שלנו להתגבר על זיהומים מבלי לחשוף את החיידקים לרמות גבוהות של אנטיביוטיקה , כצעד של משמעת ושימוש נבון באנטיביוטיקה בעתיד ומניעה של פיזור האנטיביוטיקה בסביבה ויצירה של זנים עמידים בהמשך. במהלך החלק הראשון של הניסויים הגענו לערך מינימלי של שדה שעמד על 308.86 V mm-1 עבור טיפול של אלקטרופורציה בלבד וערך של 189.65 V mm-1 עבור הטיפול המשולב של אלקטרופורציה עם אנטיביוטיקה מהולה. הודות לפעילות המשותפת הצלחנו להוריד את ערך השדה ב 61%.

במקביל לעבודה על הפרמטרים של הפולס החשמלי בוצעה במעבדה תהליך פיתוח של מחולל פולסים מסוג IGBT לצורכי מעבדה ובהמשך לטיפול בחולים פוטנציאלים. בחלק זה המכשיר נוסה לראשונה בתנאי מעבדה וכלל גם שדרוג של מטריקס הפרמטרים על סמך התובנות מניסוי טאגוצ'י. על מנת לבדוק את פיילוט המכשיר בוצעה סידרה של  14 ניסוים עם 6 חזרות, In vitro בהם המכשיר הצליח לחולל את הפולסים בפרמטרים הנדרשים, מה שאפשרו להגיע לערך שדה מינימלי של  Vmm-182 ,עבור טיפול באלקטרופורציה באלקטרודה בודדת בלבד. בעקבות השינויים שבוצעו במכלול הפרמטרים, קוטר העיכוב שנמדד היה המקסימלי שהושג ועמד על 7.8 מ"מ.

אחת מן התכונות המיוחדת של הפסאודומונאס היא היכולת שלו לבצע תהליך של ביולומיניסנציה ופלורסנציה באורך גל ספציפי, תכונה חשובה שנמצאת בקורלציה עם כמות החיידקים בדוגמא כתלות בעוצמת השטף. הודות ליכולת הזאת, בשלב השני של הניסויים, המערכת נוסתה על רקמת עור של עוף Ex vitro שעברה תהליך של ניקוי לפי פרוטוקול וזוהם עם חיידקי Pseudomonas aeruginosa עד ליצירה של ביופילם. לאחר הזיהום על גבי העור בוצע טיפול בפולסים חשמליים באלקטרודה בודדת והמדידות של השטף נעשתה לפני ואחרי הטיפול. בעקבות הטיפול ערך השטף המתקבל יריד ב 25 אחוז (75 אחוז מהאות המקורי שנמדד לפני הטיפול). בגלל שבמערכת זו אין נוכחות של מערכת החיסון לאחד הטיפול הבודד החיידקים חזרו לשגשג ולאחר 48 שעות נמדדו ערכים של מעל 100 אחוז.
בכדי להקדם צעד נוסף את המערכת לתנאים של מערכת מורכבת בוצע סדרת ניסוים על עכברי מעבדה בכדי לבחון את השפעת הפולס החשמלי על רקמה של עור חי In vivo . בניסוים אלו נעשתה כוויה טרמית מכוונת והפצע זוהם ע"י חיידק Pseudomonas aeruginosa. מהמעקב שבוצע בשיטה של ביולומינסנציה נראה כי ערך ירידה מקסימלי של 88 אחוז הושגה בטיפול ע"י הפולסים החשמליים. השוני בין אחוזי ההצלחה בטיפול בין רקמה מתה 
Ex vivo לבין רקמה חיה In vivo יכול להיות מוסבר הודות לקיום או העדר של מערכת החיסון פעילה. ההנחה היא שמעבר לאפקט הישיר של חיסול החיידקים מקומית, הפולס החשמלי יוצר אינדוקצייה מקומית של מערכת החיסון (ע"י כך שהוא עצמו יוצר סוג של נזק) וגיוס של מרכיבי מערכת החיסון שמזהים את המקום כדלקתי ופועלים ביתר שאת על מנת לחסל את החיידקים במקום.

על בסיס הידע שנצבר במהלך העבודה הצלחנו להוכיח כי במקרה של זיהומי כוויות בהם החיידק הדומיננטי הוא Pseudomonas aeruginosa ניתן להשתמש בשיטת האלקטרופורציה כאלטרנטיבה לשיטות אנטיביוטיות. השימוש המשולב של אנטיביוטיקה ואלקטרופורציה הוכיח את עצמו כשהשיג תוצאות משופרות ביחס לשימוש בכל טכניקה בנפרד ושיפור מטריקס הפרמטרים שבוצע לאחר ביצוע מטריקס טאגוצ'י הבהיר את חשיבות הפרמטרים השונים ומידת השפעתם. יש להמשיך ולחקור את הנושא ולהביא אותו עד ליישום ברמה הקלינית.