מנגנוני קליטה, עמידות וצבירת כרום בצמחים

הסטודנטית: שירה כורם

מנחה: פרופ' הלל פרום

עבודת גמר לדוקטורט

הירידה בכמות השטחים הפתוחים במקביל לעליה בזיהומים סביבתיים כתוצאה מפעילויות האדם כגון תעשיה, חקלאות ועיור מגבירים את הצורך במציאת פתרונות לזיהומי קרקע ומים. בפרט, אתרים רבים על פני כדור הארץ מזוהמים על ידי מתכות כבדות, דבר הגורם נזקים כבדים בהם אובדן קרקעות זמינות לבניה ולחקלאות, סכנת חילחול מזהמים למי התהום ופגיעה קשה בערכי הטבע והנוף. בעיה נוספת הינה מתחום הבטחון התזונתי, במעבר מתכות טוקסיות מהקרקע אל צמחי יבול.

קרקעות מזוהמות ניתן לטהר בשיטות שונות, אולם הן יהיו בדרך כלל פולשניות, אגרסיביות ויקרות מאד. פיטו-אקסטרקציה (Phytoextraction) היא טכנולוגיה אלטרנטיבית לשיקום סביבתי. בטכנולוגיה ברת קיימא זו נעשה שימוש בצמחים להעברת מתכת מהקרקע אל הנצר, שם היא מצטברת. עם זאת, המנגנונים המוליקולארים המעורבים בקליטה, מעבר וצבירה של מתכות בצמחים עדיין אינם ברורים. בפרט, בהשוואה למתכות אחרות, רק מחקרים מועטים נעשו ביחס לקליטת המתכת הכבדה כרום על ידי צמחים, זאת למרות שימושה הרב בתעשיות השונות ותפוצתה הרחבה כמזהם סביבתי.

המחקר המסוכם כאן, משתמש באסטרטגיות שונות המשלימות זו את זו להרחבת הידע לגבי המנגנונים המעורבים בקליטה, העברה  מהשורש לנצר וצבירת כרום בצמחים, כדלהלן:

1) סריקה של מיני צמחי בר בעלי פוטנציאל לתכונות עמידות או יכולת צבירה מוגברת של כרום:

צמחים מסוימים מוגדרים כ"צוברי-על" (hyperaccumulators), והם בעלי יכולת יוצאת דופן לקליטה וצבירה של ריכוזי מתכת גבוהים ברקמותיהם, זאת במקביל לעמידות גבוהה למתכת. צמחים כאלה יכולים להוות מודל למחקר האינטרקציה צמח-מתכת, והם מהווים מושא למחקרים מדעיים רבים בעשורים האחרונים. עם זאת, מחסור בסטנדרטים וכן אי דיוקים ביחס להגדרות ולניתוח הנתונים גורמים לבילבול ולחוסר קוהרנטיות במחקר הצמחים צוברי-העל.

תשעה מיני צמחים גודלו במערכת הידרופונית ונחשפו לריכוזים שונים של כרום (VI). לאחר החשיפה הצמחים יובשו, עוכלו בחומצה חנקתית ונמדדו ריכוזי הכרום בצמח על ידי ספקטרומטר (ICP-AES). במקביל, יעילות המערכת הפוטוסינטטית, לבחינת עמידות הצמח, נמדדה על ידי פלורומטר (PAM fluorometer).

בהתבסס על אמות המידה שנקבעו, לא זוהה צובר-על של כרום מבין המינים שנסרקו. צמח יכול להיות מוגדר כצובר-על באם ברקמות הנצר שלו יכול להצטבר כרום בריכוז של מעל 0.03%. מינים מסוימים, כגון חרדל הודי (Brassica juncea), קלטו ריכוזי כרום גבוהים, אולם הדבר לווה בירידה ביעילות הפוטוסינתיזה, כלומר- זוהי אינה צבירה המבוססת על עמידות. עבור מינים אחרים, כגון השיח האמריקאי קראוסוט (Larrea tridentate) ובת-אורז משושה (Leersia hexandra), לגביהם דווח בספרות שהם מציגים תכונות של צוברי-על, לא התקבלו ריכוזים גבוהים של כרום כפי שתואר. הסיבה יכולה להיות שימוש בזנים שונים או בתנאי גידול אחרים, אך גם עקב ניתוח נתונים לא מדויק. בניסויים שבוצעו במינים אלה, מיני צמחים אחרים שגודלו במקביל ובאותם תנאים, שימשו כביקורת למחקר השוואתי, הציגו יכולת קליטה דומה. כמעט כל צמח שייחשף לריכוזי מתכת גבוהים יקלוט ריכוזים גבוהים שלה ואף יצבור אותה בנצר. כאשר גבול העמידות של הצמח ישבר, יתקיים מעבר יונים לא ספציפי ולא מבוקר אל תוך הצמח, בדרך כלל תוך פגיעה קשה בתהליכים הפיזיולוגים. מכאן חשיבותם הרבה הן של כימות מצבו הפיזיולוגי של הצמח (כאן, על ידי מדידת היעילות של המערכת הפוטוסינתטתית), והן של מחקר השוואתי, דבר החסר בדיווחים רבים הנוגעים לצמחים מטאלופיטים.

כאמור, לא זוהה צמח בר המראה קליטת כרום מוגברת בליווי עמידות לריכוזי מתכת גבוהים, מסקנה המקבלת חיזוק ממאמר ביקורתי עדכני (Van der ent et al., 2013) המציע סטנדרטים מדויקים לזיהוי מינים צוברי-על, ומסכם שעד כה לא אותרו צמחי בר צוברי-על של כרום.

 

2) הערכת אפשרות תפקודם של טרנספורטים להעברת גופרית בקליטה וצבירת כרום:

בשל היות הכרום מתכת קסנוביוטית, שאינה ממלאה תפקיד בפיזיולוגיה של הצמח, ניתן להניח שלא ימצאו חלבוני ממברנה שתפקידם הספציפי העברת יוני כרום. מכיוון שכרום אכן נכנס לתאי הצמח ומצטבר ברקמותיו, היפותזת העבודה נשענה על ניסיון לאתר טרנספורטרים ממברנלים ליונים אחרים המסוגלים גם להעביר את יוני הכרום דרך המחסום הממברנלי. בשל הדמיון המבני בין יון הכרומאט לסולפאט, נבחנה תרומתם של טרנספורטרים ממברנלים של סולפאט לקליטה והעברה של כרום בצמח.

אישוש ראשון להשערה התקבל כאשר צמחי תודרנית לבנה גודלו בנוכחות ריכוזי כרום נמוכים יחסית (≤20 mg/L ). העיכוב בגדילת השורשים  בתנאים אלה הוסר כאשר במקום סולפאט סופקה לצמחים גופרית אורגנית על ידי ג'נקולאט (Djenkolate), חומצה אמינית לא-חלבונית. בריכוזי כרום גבוהים יותר, לעומת זאת, נצפתה התארכות שורשים איטית תחת שני מקורות הגופרית (סולפאט וג'נקולאט), דבר המציע שני מנגנוני פיטוטוקסיות: בריכוזים נמוכים, כרום מתחרה עם סולפאט על מנגנוני הכניסה לצמח, דבר היוצר מחסור בגופרית ועיכוב בגדילה. בריכוזי כרום גבוהים, רעילות הכרום נעשית קיצונית יותר עקב נוכחותו בריכוזים גבוהים בתוך התאים ברקמות שונות, דבר הפוגע במסלולים פיזיולוגים ומטבולים שונים.

לתודרנית לבנה שני טרנספורטרים לגופרית בעלי אפיניות גבוהה הממוקמים בממברנה הציטופלסמטית של תאי השורש, ופועלים להכנסת יוני סולפאט ממדיום הגידול אל תוך הצמח: SULTR1;1 ו- SULTR1;2. לחקירת תיפקודם המשוער בקליטת כרום, בודד מוטנט כפול הפגוע בשני הגנים הללו, sultr1;1-sultr1;2, וכן נוצר צמח טרנסגני המבטא תחת פרומוטר קונסטיטוטיבי את הרצף המקודד ל- SULTR1;2.

שני גנוטיפים קיצוניים אלה, ביחד עם זן הבר, היו מושא לניסויים פיזיולוגים שונים בנוכחות כרום. המוטנט הכפול sultr1;1-sultr1;2 הראה עמידות גבוהה לחשיפה לכרום, עמידות שהתבטאה בשיעורי נביטה גבוהים והתארכות שורשים מהירה יותר על מצע המכיל מתכת בהשוואה לזן הבר. לעומת זאת, קווי הצמחים הטרנסגנים, המבטאים ביתר את הטרנספורטר SULTR1;2, הציגו רגישות קיצונית בנוכחות המתכת עם שיעורי נביטה והשרדות נמוכים מאד בנוסף לפגיעה בקצב התארכות השורשים.

למדידת ריכוזי הכרום בגנוטיפים השונים, הצמחים גודלו במערכת הידרופונית, ובהיותם בוגרים (בני כחודשיים) הם נחשפו לכרום (VI). ריכוזי כרום נמוכים בהשוואה לזן הבר נמצאו ברקמות המוטנט הכפול, מאשרים קליטה נמוכה של יוני כרומאט על ידי השורשים. עם זאת, לא נמצא הבדל מובהק בין ריכוזי הכרום ברקמות זן הבר לצמחים הטרנסגנים.

התוצאות המתוארות מצביעות על תרומתם של שני הטרנספורטרים SULTR1;1 ו- SULTR1;2 לקליטת כרום ואף מראות שמניפולציות גנטיות בהם משנות באופן דרמטי את רגישותו או עמידותו של הצמח לגידול תחת ריכוזי כרום גבוהים, דבר היכול לאפשר יישומים חשובים בתחום הפיטורמדיאציה. נבדקו גם טרנספורטרים אחרים ממשפחת SULTR הממוקמים במקומות אחרים בצמח. תוצאות ראשוניות מצביעות גם הן על אפשרות לתרומתם בהעברת כרום בתודרנית לבנה.

בשל היות כרום מתכת כבדה, תגובת הצמח לחשיפה לכרום תהיה תגובת עקה, המפעילה מערכות שונות בצמח. קסקדת התהליכים האנזימטים המובילים ליצירת ציסטאין, המהווה פרקורסור למוליקולות שונות, ביניהן גלוטטיון ומטלותיונין, היא אחת ממערכות אלה. ביוסינתיזת ציסטאין מפעילה גם את חלבוני הממברנה האמונים על קליטה והעברה של סולפאט, דבר היוצר רשת אינטרקציות סבוכה בין שמירה על משק הגופרית בצמח, התגובה לעקה וקליטת יוני כרומאט- דרך אותם טרנספורטרים.

 

3) סריקה של ספריית מוטנטים של צמחי תודרנית לבנה (Arabidopsis thaliana) למטרת זיהוי גנים המעורבים בעמידות והומיאוסטזיס של כרום.

זוהו 4 מוטנטים משוערים בעלי שונות פנוטיפית בתגובה לכרום. המוטנטים אופיינו פיזיולוגית ונמדדה מידת עמידותם לנוכחות יוני הכרום ויעילותם בקליטת המתכת בהשוואה לזן הבר:

crm18, מקורו בהחדרת מקטע דנ"א (T-DNA), ומראה, בנוסף לעמידות לנוכחות יוני כרום, גם עמידות יחסית ליוני סלנט ואבץ, דבר המצביע ככל הנראה על מנגנון כללי ולא ספציפי לעמידות ליונים בעלי פוטנציל פיטוטוקסי, או אף לעמידות לתנאי עקה א-ביוטית כלליים.

crm88 הינו מוטנט שמקורו בחשיפה לחומר המוטגני EMS היוצר מוטציות נקודתיות ברצף הגנטי. למוטנט זה מופע ננסי והוא מתפתח באיטיות על מצע ללא כרום. בנוכחות כרום, הוא מראה עמידות גבוהה, המתבטאת בשיעורי נביטה ושרידה גבוהים ובהתארכות שורשים מהירה יותר לעומת זן הבר. ריכוזי הכרום הנמוכים שנמדדו ברקמות המוטנט מצביעים כנראה על מנגנון המנעות מיוני כרום התורם לעמידותו.

crm9, מוטנט שמקורו בהשריית מוטציות ע"י EMS, מראה גם הוא עמידות גבוהה כאשר גדל במצע המכיל כרום, וכן צבירה של ריכוזי כרום נמוכים יחסית לזן הבר, למרות שבאופן מובהק פחות מזה של crm88. עם זאת, התפצלות הצאצאים לאחר הכלאה עם זן הבר לא היתה מנדלית, דבר המעלה אפשרות של תורשה אמהית או אפיגנטית.

crm86, שמקורו גם הוא בחשיפה ל-EMS , הוא בעל מורפולגיה דומה לזן הבר בתנאי ביקורת, אולם מציג עמידות גבוהה כאשר גדל במצע המכיל כרום, ועם זאת קליטת הכרום ברקמותיו זהה לזו של זן הבר. מוטנט זה הינו אידאלי למערכות פיטורמדיאציה וכן כמודל מבטיח למחקר.

 

אוניברסיטת תל-אביב, ת.ד. 39040, תל-אביב 6997801
UI/UX Basch_Interactive