מניפולציות גנטיות והנדסה מטבולית בחיידק Lactobacillus plantarum WCFS1 להפקת ביו-אתנול

 

הסטודנט: איתי לנדאו
מנחים: פרופ' רפאל למד, ד"ר יצחק מזרחי  

הביקורת הגוברת בשנים האחרונות כלפי השימוש במקורות אנרגיה מחצביים (גז, נפט ופחם) הובילה להתעניינות גוברת  בתחליפי אנרגיה ממקורות מתחדשים. במסגרת זו חל גידול בהיקף המאמצים המושקעים בפיתוח תהליכים ביוטכנולוגיים להפקת דלקים ביולוגים, ובראשם ייצור אתנול מביומסה צמחית.

 

החיידק  Lactobacillus plantarum WCFS1 ממשפחת חיידקי חומצת החלב עושה שימוש בתסיסה לקטית בתהליך הפקת אנרגיה מסוכרים.  האנזים Lactate dehydrogenase משמש להמרת חומצה פירובית שמקורה במסלול הגליקוליזה והפיכתה  לחומצה לקטית, תהליך המלווה בייצור ATP.

 

באמצעות תכנון מושכל ושימוש בהנדסה מטבולית, ניתן להמיר את פעילות האנזיםLactate dehydrogenase בפעילות האנזימים Pyruvate decarboxylase  ו Alcohol dehydrogenase B ובכך להוביל להתמרת התסיסה הלקטית בתסיסה אלכוהולית שתוצרה הסופי - אתנול.

 

מטרת עבודה זו הייתה להדגים את ישומיות השימוש בזן החיידק  L. Plantarum WCFS1 לפיתוח מערכת מבוססת חיידקים להפקת אתנול.

 

האסטרטגיה שננקטה להשגת המטרה כללה שלושה מאמצים עיקריים:

 (1) תכנון מסלול אוטנומי להפקת אתנול מחומצה פירובית המבוסס על גרסאות סינטטיות אופטמליות לביטוי

(2)  הדגמת ביטוי הגנים המרכיבים את מסלול ייצור האתנול ברמת שעתוק.

(3)  ניטרול המסלול המטבולי לייצור החומצה הלקטית שהינו המסלול המתחרה במסלול ייצור האתנול בחיידק.

 

לאחר שנבחנה עמידותו של החיידק לנוכחות אתנול במצע הגידול (עד 15% v\v) נעשה שימוש ברצפי הגנים pdc  ו adhB מהחיידק האתנולוגני  Zymomonas mobilis המקודדים למסלול אנזימטי מלא להפיכת חומצה פירובית לאתנול.  

ראשית, נבנו גרסאות סינטטיות של גנים על ידי התמרת הרצפים הגנטיים המקוריים של הגנים מהחיידק  Z. mobilis להתאמה מקסימלית של הקודונים (codon usage preference) לביטוי בזן L. plantarum WCFS1. לאחר סינתזה כימית של הגרסאות האופיטמליות, שובטו הגנים  pdc ו adhB לתוך מערכת ביטוי ייעודית המובססת על  פלסמידים מסדרת ה pSIP אשר משמשים לביטוי מושרה של גנים ממקור חיצוני בחיידקי חומצה לקטית (1). ביטוי מושרה של גנים אלו הודגם (ברמת השעתוק) ב L. Plantarum באמצעות שימוש בqRT-PCR  (2).

 

במקביל לפעולות אלו, ננקטו פעולות לניטרול המסלול לייצור החומצה הלקטית בחיידק, באמצעות שיתוק הגנים מסוג LDH  האחראים לפעילות זו. צעד זה הינו הכרחי היות והמסלול המטבולי לייצור חומצה לקטית בחיידק, מתחרה  במסלול ייצור  האתנול על ידי ניצול יעיל של המטבוליט חומצה פירובית המהווה תוצר ביניים חיוני הן בייצור חומצה לקטית והן בייצור  אתנול. לצורך כך נעשה שימוש במערכת Cre-lox ייעודית לשיתוק גנים בחיידקי חומצה לקטית (3).

מתוך 3 גנים ידועים המקודדים לחלבוני LDH האחראים לייצור החומצה הלקטית בחיידק (ldhD, ldhL1, ldhL2), הודגמה בהצלחה שיתוק הגן ldhL2. כתוצאה מתהליך המוטגנזה נמדדה ירידה של כשני סדרי גודל ברמות השעתוק של הגן  ldhL2 בזן המוטנט. כמו כן נמצא כי שיתוק הגן ldhL2  בזן המוטנט הובילה לירידה מובהקת ברמות השעתוק של  הגנים ldhL1  ו .ldhD זנים בעלי רקע גנטי שונה - זן הבר ,WCFS1הזן המוטנט לldhL2 , וכן זנים אלו לאחר שהוחדר להם הפלסמיד המקודד  לביטוי מושרה של ייצור אתנול  - נבחנו בסדרה של פרמטרים שלהם השפעה על יכולת ייצור האתנול בחיידק.

 

מלבד ייצור אתנול נמדדו ייצור חומצה לקטית, ייצור חומצה אצטית וצריכת גלוקוז - כל זאת על פני שני  זמני אינקובאציה  שונים (24 ו 48 שעות).

 

עבור אף אחד מהזנים שנבדקו במהלך עבודה זו לא נמדדו ריכוזי אתנול במצע הגידול. כמו כן, לא נמדדה ירידה מובהקת ברמות הייצור של חומצה לקטית בזנים המוטנטים לldhL2  בהשוואה לזן הבר.

 

תוצאות אלו מציעות כי נדרשים שיפורים נוספים של המערכת ניסויית, על מנת להעמיד פלטפורמה פעילה ואפקטיבית לייצור אתנול על ידי  שימוש בזן WCFS1 L.plantarum . עם זאת, תרומתה של עבודה זאת הינה בהנחת יסודות המחקריים לקראת פיתוח פוטנציאלי של פלטפורמה חיידקית לייצור אתנול המבוססת על החיידק L.plantarum WCFS1, מתוך מטרה לשלבה ביישומים ביוטכנולגיים עתידיים להפקת אתנול מביומסה.

 

עבודת המחקר המלאה כתובה באנגלית.

 

אוניברסיטת תל אביב עושה כל מאמץ לכבד זכויות יוצרים. אם בבעלותך זכויות יוצרים בתכנים שנמצאים פה ו/או השימוש
שנעשה בתכנים אלה לדעתך מפר זכויות, נא לפנות בהקדם לכתובת שכאן >>